一、試劑準(zhǔn)備

1、SDS-PAGE 試劑：見(jiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。

2、勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇 200 ml；加 ddH2O 定容至 1000 ml。

4.、0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2 HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加 ddH2O 至 1000 ml。

5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇 80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5% 脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉 1.0 g 溶于 20 ml 的 0.01 M PBS 中。

6、顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。

 

二、蛋白樣品制備

1、單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取

（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

（2）每瓶細(xì)胞加 3 ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng) 1 min 洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

（3）按 1 ml 裂解液加 10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）

（4）每瓶細(xì)胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。

（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）

（6）于 4℃ 下 12000 rpm 離心 5 min。（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）

（7）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 0.5 ml 的離心管中放于－20℃ 保存。

2、組織中總蛋白的提取

（1）將少量組織塊置于 1～2 ml 勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

（2）加 400 μL 單去污劑裂解液裂（含 PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。

（3）幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。

（4）裂解 30 min 后，即可用移液器將裂解液移至 1.5 ml 離心管中，然后在 4℃ 下 12000 rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于－20℃ 保存。

3.、加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取

由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來(lái)，所以除按 1 操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?/p>

（1）將培養(yǎng)液倒至 15 ml 離心管中，于 2500 rpm 離心 5 min。

（2）棄上清，加入 4 ml PBS 并用槍輕輕吹打洗滌，然后 2500 rpm 離心 5 min。棄上清后用 PBS 重復(fù)洗滌一次。

（3）用槍洗干上清后，加 100 μL 裂解液（含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起 4℃、12000 rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于－20℃ 保存。

 

三、 蛋白含量的測(cè)定

1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）從－20℃ 取出 1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。

（2）取 18 個(gè) 1.5 ml 離心管，3 個(gè)一組，分別標(biāo)記為 0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。

（3）按下表在各管中加入各種試劑。

（4）混勻后，室溫放置 2 min。在生物分光光度計(jì)（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。

2、檢測(cè)樣品蛋白含量

（1）取足量的 1.5 ml 離心管，每管加入 4℃ 儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液 1 ml。室溫放置 30 min 后即可用于測(cè)蛋白。

（2）取一管考馬斯亮藍(lán)加 0.15 mol/L NaCl 溶液 100 ml，混勻放置 2 分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按 blank 測(cè)空白樣品。

（3）棄空白樣品，用無(wú)水乙醇清洗比色杯 2 次（每次 0.5 mL），再用無(wú)菌水洗一次。

（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加 95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl 溶液和 5 ml 待測(cè)蛋白樣品，混勻后靜置 2 min，倒入扣干的比色杯中按 sample 鍵測(cè)樣品。

注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水乙醇洗 2 次，無(wú)菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè)，這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是 5 ml 樣品含的蛋白量。

 

四、SDS－PAGE 電泳

1、清洗玻璃板

一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。

2、灌膠與上樣

（1）玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。）

（2）按前面方法配 10% 分離膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用 10 ml 槍吸取 5 ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）

（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等 3 min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

（4）按前面方法配 4% 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）

（6）測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含 50 ng 蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至 0.5 ml 離心管中，加入 5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為 1×。（上樣總體積一般不超過(guò) 15 μl，加樣孔的最大限度可加 20 μl 樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮 5 min 使蛋白變性。

（7）加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。

3、電泳

電泳時(shí)間一般 4～5 h，電壓為 40 V 較好，也可用 60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

 

五、轉(zhuǎn)膜

1、轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 6 張 7.0～8.3 cm 的濾紙和 1 張 7.3～8.6 cm 的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸 2 h 才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。

2、在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜。

3、將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。

4、要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋 3 張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門(mén)以使空氣流通。）

5、將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用 60 V 轉(zhuǎn)移 2 h 或 40 V 轉(zhuǎn)移 3 h。

6、轉(zhuǎn)完后將膜用 1×麗春紅染液染 5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。

 

六、免疫反應(yīng)

1、將膜用 TBS 從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉 1 h。

2、將一抗用 TBST 稀釋至適當(dāng)濃度（在 1.5 ml 離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。

3、同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

 

七、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

1、將 A 和 B 兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min 后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min 后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入 X-光片夾中。

2、在暗室中，將 1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中；在紅燈下取出 X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大 1 cm）；打開(kāi) X-光片夾，把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上 X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為 1 min 或 5 min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開(kāi) X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為 1～2 min（20～25℃），溫度過(guò)低時(shí)（低于 16℃）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把 X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為 5～10 min，以膠片透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

 

八、凝膠圖象分析

將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。